RDEB gen terapiyasının çatdırılmasının təkmilləşdirilməsi

Bu layihədə tədqiqatçılar laboratoriyada xəstə hüceyrələrində pozulmuş RDEB genini (kollagen-7) əvəz etmək və gen redaktoru müalicələrini birbaşa insanın hüceyrələrinə çatdırmaq üçün gen terapiyası üsullarını yaratmışlar. Bir çox insan insan viruslarına yoluxduğuna və insan viruslarından istifadə edərək gen terapiyasının effektivliyini azaldacaq immun reaksiyaya malik ola bildiyinə görə, yeni sistem donuz virusundan istifadə edir. Yan təsirlərə səbəb olma ehtimalı da azdır, çünki virusu iki hissəyə, gen terapiyasını ehtiva edən, lakin virus genləri olmayan "amplikon" vektora və özünü çoxalda bilməyən, lakin gen terapiyasının yaradılmasına kömək edən "köməkçi" virusa bölür.

Yeni virus sistemi xəstənin dəri hüceyrələrinə yeni işləyən Kollagen-7 resepti əlavə edə, həmçinin xəstənin dəri hüceyrələrində genetik dəyişikliyi düzəltmək üçün gen redaktə vasitələri əlavə edə bilər. Birincisi müvəqqəti olaraq RDEB dərisinin daha yaxşı yapışmasına kömək edə bilər, ikincisi isə uzunmüddətli yaxşılaşmaya səbəb ola bilər.

Növbəti addım, həm daha effektiv yaraların sağalmasını, həm də əsas genetik dəyişikliyin uzunmüddətli korreksiyasını təklif edən dəri müalicələrinə çevrilməmişdən əvvəl bu gen terapiya variantlarını dəri modellərində sınaqdan keçirmək olacaq.

Tədqiqatçılar yeni gen terapiyasına başlamaq üçün laboratoriyada yetişdirilən hüceyrələrdən istifadə ediblər.
Onların məqsədi gen terapiyasını daha səmərəli və daha böyük miqdarda etməkdir və ilkin təcrübələrinin bunun mümkün olduğunu göstərdiyini bildirirlər.

Aparıcı tədqiqatçı:

Dr Ángeles Mencía nadir xəstəliklərin molekulyar diaqnostikasında 20 ildən çox təcrübəyə malikdir, epidermoliz büllozunun diaqnostikası üçün panellər də daxil olmaqla gələcək nəsil ardıcıllığına əsaslanan diaqnostik vasitələrin dizaynında, təsdiqində və tərcüməsində iştirak edir. O, klinikaya köçürülən genlərin redaktəsi üçün molekulyar vasitələrin hazırlanmasında böyük təcrübəyə malikdir.

Tədqiqatçılar:

Dr Silvia Gómez-Sebastián Madrid Autonoma Universidad Tibb fakültəsinin dosentidir. O, virusların genetik manipulyasiyasında 20 ildən çox təcrübəyə malikdir, tədqiqatçı kimi ilk illərində herpes virusları ilə işləyir. O, Friedreich's Ataxia xəstə hüceyrələrində frataksini (FA) bərpa etmək üçün tam FRDA lokusunu daşıyan HSV-1 amplikon vektorları ilə işləmişdir.

Dr Rodolfo Murillas epidermal transgenez, dərinin gen terapiyası üçün viral vektorların inkişafı və gen vasitəsilə distrofik epidermoliz büllozunun korreksiyası üçün eksperimental protokolların işlənib hazırlanması da daxil olmaqla dəri biologiyası sahəsində geniş təcrübəyə malik CIEMAT-ın baş elmi işçisidir. redaktə.

Dr Mirentxu Santos hüceyrə mədəniyyətləri, ilkin kulturalar, molekulyar və hüceyrə biologiyası, hüceyrə dövrü və siqnal yolları üzrə geniş təcrübəyə malik CIEMAT-da baş alimdir.

Dr Marta García Universidad Carlos III de Madrid UC3M-də toxuma mühəndisliyi professorudur. Dr García genodermatozun molekulyar tədqiqi ilə çoxdan maraqlanır və nadir dermatoloji xəstəliklər üçün insaniləşdirilmiş dəri modellərinin işlənib hazırlanması üzrə tanınmış mütəxəssisdir.

Diana de Prado, 2023-cü ildən başlayaraq, Drs Mencia və Murillasın nəzarəti altında doktorluq dissertasiyası üzərində işləyən Məzun Tələbəsidir.

“Son illərdə RDEB üçün gen terapiyasındakı irəliləyişlər bizə effektiv və topikal olaraq tətbiqi sadə, lakin xəstələrin həyatını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmaq potensialı olan müalicələri nəzərdə tutmağa imkan verir.

Bu vektorlardan istifadə edərək uğurlu gen redaktəsi patogen allellərin ifadəsini aradan qaldırmaq üçün dominant EBS və ya EBD kimi digər EB növlərini allele-spesifik CRISPR/Cas alətləri ilə müalicə etmək imkanını açır.”

- Doktor Angeles Mencía

Qrant adı: RDEB Terapiyası üçün daha təhlükəsiz Pseudorabies Herpesvirus əsaslı Vektorların yaradılması üçün Yeni Platforma.

Gen terapiyası mutasiyaları düzəltmək üçün müxtəlif strategiyalar vasitəsilə resessiv distrofik EB (RDEB) üçün potensial müalicəvi müalicə kimi ortaya çıxdı. Viral vektorlar mutasiyaları düzəltmək və ya təsirlənmiş zülalın bərpasına kömək edən sağlam genləri nəql etmək üçün lazım olanları daşımaq üçün istifadə olunan laboratoriya alətləridir. Bu laboratoriya alətləri adətən adenoviruslar və ya herpes virusu kimi müxtəlif viruslardan gəlir.

Əvvəllər qrupumuz adenovirusdan əldə edilən vektorların Kollagen VII-ni bərpa etmək və in vivo olaraq dermis və epidermis arasında yapışmanı bərpa etmək üçün faydalı olduğunu nümayiş etdirdi. Bundan əlavə, virus vektorlarının dizaynında yeni irəliləyişlər RDEB dərisinin daha geniş və effektiv müalicəsinə doğru irəliləməyə imkan verəcəkdir. Herpes virusundan əldə edilən vektorlar dərini yoluxdurmaq üçün təbii qabiliyyətlərini nəzərə alaraq EB gen terapiyası üçün böyük potensiala malikdir. Bu yaxınlarda keçirilən klinik sınaq, RDEB olan insanların yaralarına COL1A7 geninin funksional versiyasını çatdırmaq üçün herpes simplex virusu (HSV-1) vektorundan istifadə etdi. Nəticələr yaraların yaxşılaşmasının əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdığını və blisterlərə qarşı müqavimətin artdığını göstərdi. Bu ümidverici nəticələr, RDEB terapiyası üçün herpes virusundan törəmə vektorların potensialını təsdiqləyir.
Bununla əlaqədar olaraq, komandamız donuz psevdorabiləri virusu (Herpesviridae ailəsi) əsasında yeni vektor platforması hazırlayır ki, bu da HSV-1-dən bəzi üstünlüklərə malikdir, çünki daha təhlükəsiz və böyük miqdarda istehsal etmək asandır. Bu yeni platformaya əsaslanaraq, biz RDEB üçün vektorlar yaratmağı təklif edirik, hazırda klinik sınaqlarda sınaqdan keçirilənlərlə müqayisə oluna bilər və aktual tətbiqdən sonra daha uzunmüddətli korreksiya potensialı ilə.

Komandamız RDEB müalicəsinə yanaşmada inqilab edə biləcək effektiv və asan idarə olunan topikal müalicələr hazırlamaq üçün çox çalışmışdır. İnvaziv və ağrılı cərrahi prosedurları əhatə edən ənənəvi gen greft terapiyası üsullarından fərqli olaraq, bizim yanaşmamız dəri greftləri ilə müalicəsi mümkün olmayan xroniki yaraların və zədələrin sağalmasını yaxşılaşdırmağa yönəlmiş topikal gen terapiyasına yönəlmişdir. Laboratoriyamız davamlı təkmilləşdirmələrə nail olmaq potensialı ilə RDEB mutasiyalarının korreksiyası üçün molekulyar gen redaktə vasitələrinin hazırlanmasında öncül olmuşdur. Bu yaxınlarda biz preklinik modellərdə Kollagen VII və dermis və epidermis arasındakı yapışmanı uğurla bərpa etdik.

Hazırda biz bu məqsədlə yeni tip vektorlar, xüsusən də dərini yoluxdurmaq üçün güclü təbii qabiliyyətə malik olan herpesəbənzər viruslardan əldə edilən və buna görə də RDEB olan insanlarda xroniki yaraların müalicəsində yüksək effektli ola bilən yeni vektorlar inkişaf etdiririk. Təklif etdiyimiz yanaşmaya bənzər yanaşmalara əsaslanan ABŞ-da son klinik sınaqlardan əldə edilən ümidverici nəticələr bizə düzgün istiqamətdə hərəkət etdiyimizə əminlik verir. Bu tədqiqat xətti RDEB-nin müalicəsini inkişaf etdirmək üçün əla fürsətdir və biz işimizi həvəs və ciddiliklə davam etdirməyə sadiqik.

Məqsədimiz bu xəstəlikdən əziyyət çəkənlərə ümid vermək və onların həyat keyfiyyətini yaxşılaşdırmaqdır. Biz birlikdə RDEB ilə mübarizə aparanlar üçün daha parlaq və perspektivli gələcəyə doğru irəliləyə bilərik.

Herpes virusundan əldə edilən yeni vektorlar epidermolizin müalicəsi üçün böyük vədlər verir və bu zəiflədən dəri vəziyyəti üçün potensial müalicə təklif edir. Bu müalicələrin klinik istifadəyə yararlı olması üçün bu vektorların böyük miqdarda istehsal edilməsi çox vacibdir. Amplikon vektorları, herpes törəmə vektorlarının alt sinfi, viral genləri olmadığı üçün daha təhlükəsiz alternativ təqdim edir. Bununla belə, onların istehsal prosesi köməkçi herpes virusları ilə birgə istehsal ehtiyacı ilə çətinləşir.

Layihəmiz terapevtik vektorların məhsuldarlığını artırmaq və bununla da son hazırlıqların keyfiyyətini optimallaşdırmaq üçün nəzərdə tutulmuş innovativ istehsal platforması təklif edir. İlkin mərhələdə biz PK15 istehsalçı hüceyrələrini modifikasiya etdik ki, köməkçi virusları aradan qaldıraraq üstünlüklü olaraq istədiyiniz vektoru istehsal etdik. Bu yanaşma vektor/köməkçi nisbətini uğurla terapevtik vektorun xeyrinə dəyişərək, bu istehsal strategiyası üçün konsepsiyanın sübutu rolunu oynadı və dizaynımızın effektivliyini nümayiş etdirdi. İrəliləyərək, istehsal platformasını daha da təkmilləşdirmək və təkmilləşdirmək üçün xüsusi hüceyrə klonlarını seçirik. Klonal populyasiyanın köməkçi vektorların inaktivasiyasını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdıracağı və bununla da terapevtik vektorların çıxışını artıracağı gözlənilir.

DEBRA UK-nin səxavətli maliyyəsi ilə mümkün olan bu iş vektor istehsalında əhəmiyyətli irəliləyiş olmaqla yanaşı, həm də qabaqcıl terapevtik variantların inkişafı istiqamətində mühüm addımdır. O, epidermolizdən əziyyət çəkən xəstələr üçün ümid və daha parlaq gələcək təklif edir, yeni müalicə üsullarını və yaxşılaşmış həyat keyfiyyətini xəbər verir. 2024-cü ildən irəliləyiş hesabatı.

Layihəmiz epidermoliz büllozunda (EB) həm keçici, həm də daimi terapevtik ehtiyacları qarşılamaq üçün nəzərdə tutulmuş herpesvirus vektor sistemini araşdırır. EB xəstələrinin məruz qaldıqları xroniki lezyonlar və yaralar üçün aktual müalicələrin inkişafı preklinik tədqiqatlardakı irəliləyişlər sayəsində indi əlçatandır. Bu irəliləyişlər iki cəbhədə əldə edilmişdir: molekulyar biologiya və gen terapiyası.

Birinci irəliləyiş, gen redaktə texnologiyasından istifadə edərək xəstəliyin genetik mutasiyalarını düzəltmək üçün genetik vasitələrin hazırlanmasıdır. Bizim işimiz bizə COL80A7 geninin 1-ci ekzonunda yüksək yayılmış mutasiyaya malik xəstələrin hüceyrələrini düzəltmək və CRISPR ilə müalicə olunan hüceyrələrin Kollagen VII(C7) istehsalını və dermis və epidermis arasında yapışmanı bərpa etməsini təmin etmək üçün ən çox yönlü gen redaktə vasitələrini, CRISPR sistemini uyğunlaşdırmağa imkan verdi.

İkinci irəliləyiş xəstələrin dərisinə düzəldici vasitələri çatdırmaq üçün istifadə olunan nəqliyyat vasitələrinə aiddir. Son illərdə klinik sınaqlar krem ​​şəklində yerli tətbiq edildikdə, herpes viruslarından əldə edilən vektorların dəri hüceyrələrini genetik cəhətdən dəyişdirmək potensialını nümayiş etdirdi. Artıq FDA və EMA tərəfindən klinik istifadə üçün təsdiqlənmiş bu vektorlar EB olan xəstələrdə dəri lezyonlarının tətbiqi sahəsində C7 ifadəsinin müvəqqəti bərpasına imkan verir, yaraların sağalmasını asanlaşdırır. Burada hazırlanmış yeni herpesvirus vektoru yaraların sürətli sağalmasını təmin etmək potensialına malik olan bu keçici zülal çatdırılmasını təkrarlayır. Bundan əlavə, CRISPR gen redaktə qabiliyyətinin inteqrasiyası eyni vektor platformasının kollagen domenində mutasiyalar daşıyan xəstələrdə davamlı təmir müalicəsi üçün potensiala malik olmasına imkan verir.

Bu layihədə biz hər iki növ vektor qurmuşuq və onları təbii olaraq donuzlara təsir edən herpes virusundan (donuz psevdorabiyası virusu) əldə edilən yeni herpes vektor platformasında istehsal etmişik. Bu platforma potensial üstünlükləri ilə herpes simplexdə inkişaf etdirilən platformaya alternativdir. Birincisi, müalicəni asanlaşdıracaq insanlarda bu vektora qarşı immunitetin olmamasıdır. İkincisi, daha aşağı toksiklik, immunogenlik və təkmilləşdirilmiş vektor ifadə səviyyələri baxımından əlverişli olan "amplikon" vektoru adlanan viral genləri olmayan vektor şəklində dizayndır. Bu herpesviral vektor üçün amplikon dizaynının hazırlanması sistemdə mümkün qədər az müşayiət olunan qeyri-replikasiya edən virus (köməkçi virus adlanır) ilə faydalı miqdarda vektor istehsal etmək üçün sistemdə dəyişikliklər tələb edir. Bu özünü təsirsiz hala gətirən platforma uğurla tamamlandı.

Biz pseudorabies herpesvirus amplikon vektorlarının, o cümlədən virus istehsalçısı kimi fəaliyyət göstərən hüceyrələr, herpesviral konteynerlərdə kapsullaşdırılmış amplikonlar və hüceyrələr daxilində öz replikasiyasının qarşısını almaq üçün nəzərdə tutulmuş dəyişdirilmiş köməkçi virusun istehsalı üçün hərtərəfli sistem işləyib hazırlamışıq. Bu sistem vektor istehsalında əsas problemləri effektiv şəkildə həll edən gen terapiyası texnologiyasında əhəmiyyətli irəliləyişi təmsil edir. Biz yeni platformadan əlavə olaraq C7-nin bərpası üçün bir vektor (dermis-epidermis yapışmasının müvəqqəti bərpası üçün hər hansı RDEB xəstəsini müalicə etmək potensialı ilə) və redaktə yolu ilə C7-nin bərpası üçün başqa bir vektor yaratmaq üçün istifadə etdik (uzunmüddətli yapışma bərpası üçün ekson 80-də yüksək yayılmış mutasiya daşıyan xəstələri müalicə etmək potensialı ilə). Biz hər iki vektoru sınaqdan keçirdik və onların funksionallığını ekson 80 mutasiyasını daşıyan xəstədən əldə edilən keratinosit xəttində nümayiş etdirdik. Köməkçi vektordan mümkün olan ən az çirklənmə ilə faydalı miqdarda vektor istehsal edənə qədər istehsal protokollarını təfərrüatlandırmaq üçün əlavə iş lazımdır, lakin platformanın funksional olduğu sübuta yetirilib və biz onun inkişafının təkcə RDEB deyil, həm də başqa genlərlə əlaqəli digər genodermatoz formalarını müalicə etmək üçün yeni herpesvirus vektorlarının istehsalı üçün böyük potensiala malik olduğuna inanırıq.

Növbəti addım immunçatışmazlığı olan modellərdə regenerasiya olunmuş xəstə dərisindən və RDEB modelindən istifadə edərək laboratoriyamızda olanlar kimi bu vektor istehsallarını preklinik in vivo modellərdə sınaqdan keçirmək olacaq. Bu yeni vektor platformasının inkişafı təkcə resessiv distrofik EB-nin müalicəsi üçün deyil, həm də dəri xəstəlikləri ilə bağlı digər genetik şərtlərin müalicəsi üçün yeni imkanlar açır. CRISPR gen redaktəsini qabaqcıl virus daşıma sistemləri ilə birləşdirərək, biz EB xəstələrini həm dərhal yaraların sağalmasını, həm də əsas genetik qüsurun uzunmüddətli korreksiyasını təklif edən aktual məhsullarla təmin etməyi hədəfləyirik. Biz inanırıq ki, bu yanaşma EB və oxşar xəstəliklər üçün müalicə mənzərəsini dəyişdirmək potensialına malikdir. (2025-ci ilin yekun tərəqqi hesabatından.)